Вернуться к журналу 2018 г., №3

Влияние ноотропных препаратов на 5-НТ2А-рецепторы стриатума аутбредных мышей с различной эффективностью исследовательского поведения

  • 3 месяца назад
  • Журнал: 2018 г., №3
  • 224

Резюме. Изучено влияние субхронического введения ноотропных препаратов различного строения (пирацетама   200 мг/кг/день, пантокальцина 200 мг/кг/день, семакса 0,6 мг/кг/день, нооглютила 50 мг/кг/день) мышам аутбредной линии 1CR на спонтанную исследовательскую активность в закрытом крестообразном лабиринте и на характеристики связывания серотониновых рецепторов 5-HT2А-типа в мембранах стриатума. В экспериментах с использованием [3H](+)Кетансерина установлено, что мозг мышей, проявляющих низкую эффективность исследовательского поведения (НЭИП) в тесте «закрытый крестообразный лабиринт», отличается более низкой плотностью 5-HT2А-рецепторов   (Bmax = 519 ± 13 фмоль/мг, р = 0,02) по сравнению с субпопуляцией с высокой эффективностью исследовательского поведения (ВЭИП) (639 ± 48 фмоль/мг). После 5-кратного введения ноотропов лишь в группах с НЭИП наблюдалось значимое увеличение величины Bmax под действием всех исследованных ноотропов: пирацетама (643 ± 42 фмоль/мг); пантокальцина (662 ± 29 фмоль/мг); семакса (742 ± 29 фмоль/мг) и нооглютила (1145 фмоль/мг) при р = 0,01. По величине Kd субпопуляции исходно не различались и не претерпевали значимых изменений под действием препаратов. Наличие серотонин-позитивных эффектов у всех исследованных препаратов на животных с пониженным содержанием рецепторов согласуется с гипотезой об избирательном, модулирующем характере действия веществ с ноотропным эффектом.

The Effects of Nootropic Drugs on Striatal 5-НТ2А-Receptors in Outbred Mice with Different Efficacy of Exploratory Behavior

Resume. The effect of subchronic administration of nootropic drugs of different structures (piracetam 200 mg/kg/day, pantocalcin 200 mg/kg/day, semax 0.6 mg/ kg/day, nooglutil 50 mg/kg/day) to mice of the outbred line 1CR on spontaneous research activity in a closed cross-maze and on the binding characteristics of 5-HT2A-receptors in striatal membranes. In experiments using [3H] (+)Ketanserin, it has been established that the mice brains exhibiting a low efficacy of exploratory behavior (LEEB) in the closed cross-maze test has a lower density of 5-HT2A receptors (Bmax = 519 ± 13 fmol/ mg , p = 0.02) in comparison with the subpopulation with high efficacy of exploratory behavior (HEEB) (639 ± 48 fmol / mg). After 5-fold administration of nootropics, only in groups with LEEB there was a significant increase in the Bmax value under the action of all investigated nootropics: piracetam (643 ± 42 fmol/mg); pantocalcine (662 ± 29 fmol/mg); semax (742 ± 29 fmol/mg) and nooglutil (1145 fmol/mg) at p = 0.01. By the Kd value, the subpopulations did not initially differ and did not undergo significant changes under the action of the drugs. The presence of serotonin-positive effects of all drugs studied in animals with initially reduced receptor density is consistent with the hypothesis of the selective, modulating nature of the nootropics action.

Введение

Cеротонинергическая система осуществляет в мозге модулирующее влияние на большинство основных функций центральной нервной системы, включая память, мышление, эмоции, восприятие, настроение и сознание [1–4]. В осуществлении этих процессов задействовано множество взаимодействующих друг с другом нейромедиаторных систем мозга. В частности, существуют точки зрения о зависимости процессов памяти от баланса активностей серотонини дофаминергической систем мозга [5, 6], серотониновой и глутаматергической [7]. Из 14 подтипов серотониновых рецепторов отдельный интерес для фармакологии интегративных функций представляют 5-НТ2А-рецепторы [8]. Обладая возбуждающим действием, эти рецепторы способны усиливать выброс глутамата, обеспечивая его взаимодействие (модулирующее действие) с различными типами глутаматных рецепторов (АМРА, mGluR2/3, mGluR5) [9]. С другой стороны, в ранее проведённых нами экспериментах с ноотропны ми препаратами, обладающими прокогнитивными свойствами, на фенотипических и генотипических моделях дефицита исследовательской активности в крестообразном лабиринте [10, 11] было показано, что все они проявляют своё избирательное модулирующее действие на н-холинои NMDA-рецепторы в префронтальной коре и гиппокампе животных с исходным дефицитом исследовательской активности [12–15]. Вместе с тем известно, что определённую роль в осуществлении процессов обучения и памяти играют базальные ядра мозга – хвостатое ядро, скорлупа, бледный шар, субталамическое ядро, чёрная субстанция, обладающие отдельными нейронными связями с зонами коры мозга [16]. Однако роль 5-HT2A-рецепторов стриатума в механизме формирования ноотропного эффекта оставалась неизученной.

Таким образом, в предпринятом исследовании предполагалось: (а) сравнить вклад 5-НТ2А-рецепторов в стриатуме в активность исследовательского поведения типированных по эффективности поведения в крестообразном лабиринте мышей 1CR; и (б) оценить на них влияние отечественных ноотропов пантокальцина, семакса и нооглютила в сравнении с пирацетамом.

Материалы и методы

Животные. Исследования проводили на 75 самцах мышей аутбредной линии 1CR (питомник Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) массой 30-35 г. Содержание животных соответствовало действующим санитарным правилам по содержанию лабораторных животных. Использовался полный рацион экструдированного брикетированного корма (ГОСТ на корм Р 50258-92). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» [17]. Эксперименты проводили с 10 до 16 часов. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Препараты и дозы. Пирацетам – 200 мг/кг/ день (UCB); пантокальцин – 200 мг/кг/день (ФГУП СКТБ «Технолог»); семакс – 0,6 мг/кг/день (ОХФАВ ИМГ РАН), нооглютил – 50 мг/кг/день (Отдел химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»). Препараты были использованы в дозах, эквипотенциальных по антиамнестическому эффекту, согласно результатам ранее проведённых экспериментов в тестах УРПИ [11].

Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте. Оценку ноотропной активности пирацетама, нооглютила, семакса и пантокальцина осуществляли на мышах по тесту спонтанной ориентации (поведения патрулирования) в крестообразном лабиринте, который позволяет одновременно выявлять признаки ноотропного, анксиолитического, седативного, психостимулирующего действия веществ [10, 12]. С помощью теста мышей аутбредной линии 1CR разделяли на две субпопуляции с высокой (ВЭИП) и низкой (НЭИП) исследовательской активностью. Далее типированных животных случайным образом разделяли на группы, получавшие исследуемые препараты. Инъекции проводили в/б ежедневно в течение 5 дней. По истечении этого срока животных повторно тестировали в крестообразном лабиринте, через 24 часа после последней инъекции декапитировали, выделяли стриатумы, которые размещали по группам в криопробирки и хранили в жидком азоте для последующего радиолигандного анализа. Подробное описание метода и результатов поведенческих тестов описано в наших ранних работах [13, 15].

Радиолигандное связывание

Приготовление мембранного материала. Через 24 часа после последней инъекции животных подвергали цервикальной дислокации и декапитации, быстро извлекали мозг на лёд. Стриатумы после выделения замораживали в жидком азоте.

В дальнейшем структуры размораживали и гомогенизировали в отмывочном буфере (50 мМ TrisHCl, рН 7,4). Полученный гомогенат разбавляли 50 объёмами отмывочного ледяного (0-40 °С) и центрифугировали при 40 000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант сливали, осадок ресуспендировали в том же объёме отмывочного буфера и повторно центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный конечный осадок ресуспендировали в 10 мл инкубационного буфера.

Радиолигандный анализ 5-HT2А-рецепторов. В эксперименте использовали меченный тритием (+)Кетансерин (“PerkinElmer”) с удельной активностью 40 Кюри/ммоль. Реакционная смесь (конечный объём 0,5 мл) содержала 200 мкл инкубационного буфера (Tris-base – 6,050 г, NaCl – 6,955 г, KCl – 0,369 г, CaCl2 – 0,293 г, MgCl2 – 0,202 г, паргилин –2 мг, аскорбиновая кислота – 1 г, pH = 7,4), 50 мкл меченного лиганда (в диапазоне концентраций от 0,1 до 30 нМ) и 250 мкл суспензии белка мембран. Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 50 мкл немеченого лиганда (+) Кетансерина (1μМ), которое составляло 12-14 % общего. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при непрерывном встряхивании в шейкере. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные в 0,3 % полиэтиленимине в течение 2 часов при 40 °С. Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером, затем фильтры промывали три раза тем же объёмом буфера. Фильтры просушивали на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы. Фильтры заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0,2 г POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (“PerkinElmer”) с эффективностью счёта 45-50 %. Для обработки результатов радиолигандного связывания использовали программу GraphPadPrism 4 Demo. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0 (“StatSoft”, Tulsa, OK, USA). При обработке полученных результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики (t-тест Стьюдента, χ2, F-критерий Фишера) согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [17].

Результаты и их обсуждение

Нейромедиатор серотонин выполняет множественные функции по модулированию информационных процессов посредством активации обширного семейства 5-НТ-рецепторов, включающего подтипы семиспиральных рецепторов GPCRs (5-HT1, 5-HT2, 5-HT4-7) и канальный 5-HT3. Наибольшая   популяция   серотонергических нейронов локализована в среднем мозге, особенно в ядрах шва (raphenuclei). Медиальное и дорзальное ядра шва обеспечивают общие проекции, иннервация базальных ядер (стриатума, субталамических ядер, чёрной субстанции) осуществляется из второго, входя в т. н. «кортико-базальноталамические» пути, играющие роль в контроле моторных, эмоциональных и когнитивных функций [16, 18]. Следовательно, 5-HT2А-рецепторы представляют собой важные мишени для воздействия фармакологическими средствами [8]. Открытие [3H]-Кетансерина в качестве селективного лиганда для рецепторов 5-НТ2А-подтипа [19] оказалось важным событием, которое существенно продвинуло исследования этих важных рецепторов.

Для изучения индивидуально-типологического рецепторного профиля препаратов использовали апробированный комплексный поведенческо-нейрохимический подход с привлечением неинвазивной методики типирования животных по уровню эффективности исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте [13]. После субхронического введения ноотропных препаратов типированным животным в условиях насыщения радиолигандного связывания exvivo тритированного лиганда серотониновых рецепторов кетансерина изучали изменение характеристик связывания 5-НТ2А-рецепторов в стриатуме.

Модуляция эффективности синаптической передачи рецепторами осуществляется двумя молекулярными механизмами. С одной стороны, это изменение чувствительности (сродства) к рецептору, с другой – увеличение или снижение количества активных рецепторов на мембране. Чтобы определить, с чем связаны изменения в специфическом связывании [3Н](+)Кетансерина с мембранами стриатума – с изменениями в сродстве или количестве мест связывания, – были проведены кинетические исследования по определению параметров связывания – константы диссоциации Кd и максимального числа мест связывания Вmах. Для этого был применён метод насыщения связывания радиолиганда мембранами стриатума, результаты которого для субпопуляций НЭИП и ВЭИП приведены на рис. 1А и Б соответственно. Далее эти зависимости были преобразованы в координатах Скетчарда (рис. 2А и Б), из которых были рассчитаны величины Вmах и Кd, представленные в табл. 1.

Таким образом, было установлено, что у контрольных животных из субпопуляции с НЭИП количество мест связывания [3Н](+)Кетансерина в стриатуме на 20 % ниже (Bmax = 519 ± 13 фмоль/мг), чем у субпопуляции с ВЭИП (Bmax = 639 ± 48).

Эти данные совпадают со сведениями о меньшем содержании 5-НТ2А-рецепторов в мозге больных с мягкими когнитивными нарушениями, которые были получены с помощью методов ядерно-магнитного резонанса (MRI) и позитронно-эмиссионной томографии (PET) c использованием [18F]-алтансерина. При этом сниженная плотность 5-НТ2А-рецепторов в стриатумах больных существенно коррелировала с проявлением депрессии и тревоги по шкале NPI-Q [20].

С другой стороны, оставалась не изученной роль 5-НТ2А-рецепторов в механизме действия ноотропных препаратов. В ранее опубликованных работах нами было показано, что специфический эффект ноотропов проявляется при использовании животных с когнитивным дефицитом, который сопровождался сниженной плотностью NMDA-рецепторов и концентрацией мозгового фактора BDNF в гиппокампе, увеличенным количеством н-холинорецепторов в префронтальной коре мозга мышей [11, 13, 15].

Поэтому в следующей серии экспериментов были изучены эффекты субхронического введения отечественных ноотропов пантокальцина, семакса и нооглютила в сравнении с пирацетамом на связывание [3Н](+)Кетансерина мембранами стриатумов мышей с низкой и высокой эффективностью поведения в закрытом крестообразном лабиринте.

Субхроническое введение каждого из четырёх препаратов увеличило количество мест связывания [3Н](+)Кетансерина только у животных с НЭИП: пирацетам на 24 % (Bmax = 643 ± 42 фмоль/мг); нооглютил на 120 % (Bmax = 1145 ± 136 фмоль/мг); семакс на 43 % (Bmax =742 ± 29 фмоль/мг) и пантокальцин на 28 % (Bmax = 662 ± 29 фмоль/мг). В группах с ВЭИП статистически значимых изменений в количестве рецепторов серотонина под действием препаратов не наблюдалось (см. табл. 1) (рис. 2).

Величина константы диссоциации (Кd) оставалась неизменной между субпопуляциями. После субхронического введения препаратов также не наблюдалось статистически значимых изменений в данном параметре радиолигандного связывания (табл. 1) (рис. 1–2).

Следовательно, наличие серотонин-позитивных эффектов у всех исследованных препаратов на животных с пониженным содержанием рецепторов согласуется с ранее полученными данными [11] об избирательном, модулирующем характере действия веществ с ноотропным эффектом. Обнаруженное увеличение количества 5-HT2А-рецепторов серотонина, возможно, связано со стимуляцией препаратами нейропластических процессов в головном мозге.

Выводы

1.           Субпопуляция мышей линии 1CR, характеризующаяся низкой эффективностью исследовательского поведения в крестообразном лабиринте, обладает 20 % дефицитом мест специфического связывания [3H](+)Кетансерина в мембранах стриатума по сравнению с мышами с высокой исследовательской активностью.

2.           Показано, что 5-кратное системное введение пирацетама, пантокальцина, семакса и ноотропила увеличивает, соответственно, на 24, 28, 43 и 120 % показатели плотности 5-НТ2А-рецепторов мембранами стриатума лишь в субпопуляции со сниженной эффективностью исследовательского поведения.

3.           Результаты указывают на специфический модулирующий характер участия 5-НТ2А-рецепторов стриатума в механизме действия ноотропных препаратов при неинвазивном моделировании дефицита исследовательской активности.

Литература / References

1.           Archer T. Serotonin and fear retention in the rat. J Comp Physiol Psychol. 1982;96:491–516. DOI: 10.1037/h0077897

2.           Aghajanian GK, Andrade R. Electrophysiology of 5-HT receptors. In: Baumgarten HG, Gothert M, eds. Serotonergic neurons and 5-HT receptors in the CNS. Berlin: Springer-Verlag; 1997. p. 499–535. DOI: 10.1007/978-3-642-60921-3_19

3.           Harvey JA. Role of the Serotonin 5-HT 2A Receptor in Learning. Learning & Memory. 2003;10(5):355–362. DOI: 10.1101/lm.60803

4.           Aznar S, El-Sayed Hervig M. The 5-HT2A serotonin receptor in executive function: Implications for neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 2016;64:63–82. DOI: 10.1016/j.neubiorev.2016.02.008

5.           Prinssen EP, Kleven MS, Коек W. Effects of dopamine antagonists in a two way active avoidance procedure in rats: Interactions with 8-OHDPAT, ritanserin, and prazosin. Psychopharmacology. 1996;128:191–197. DOI: 10.1007/s002130050124

6.           Luciana M, Collins PF, Depue RA. Opposing roles for dopamine and serotonin in the modulation of human spatial working memory functions. Cerebral Cortex. 1998;8:218–226. DOI: 10.1093/cercor/8.3.218

7.           Zhang C, Marek GJ. AMPA receptor involvement in 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated pre-frontal   cortical   excitatory synaptic currents and DOI-induced head shakes. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2008;32(1):62–71. DOI: 10.1016/j.pnpbp.2007.07.009.

8.           Roth B. Irving Page Lecture: 5-HT 2A serotonin receptor biology: Interacting proteins, kinases and paradoxical regulation. Neuropharmacology. 2011;61:348–354. DOI: 10.1016/j.neuropharm.2011.01.012

9.           Meneses A. Neurotransmitters and Memory: Cholinergic, Glutamatergic, GABAergic, Dopaminergic, Serotonergic, Signaling, and Memory. Identification of Neural Markers Accompanying Memory. 2014;5– 45. DOI: 10.1016/B978-0-12-408139-0.00002-X

10.         Салимов Р.М. Оценка упорядоченности пути в процессе исследовательского поведения у мышей // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. – 1988. – Т.38. – №3. – С.569–571. [Salimov RM. Otsenka uporyadochennosti puti v protsesse issledovatel'skogo povedeniya u myshej. Zhurnal vysshej nervnoj deyatel'nosti im. I.P. Pavlova. 1988;38(3):569–571. (In. Russ).]

11.         Ковалев Г.И. Фармакодинамика ноотропных средств. Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2018. – Т.81. – №S. – С. 114. [Kovalev GI. Farmakodinamika nootropnyih sredstv. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya. 2018;(81 suppl. S):114. (In. Russ).]

12.         Salimov RM, Kovalev GI. Effects of N-cholinergic drugs on behavior in the explorative cross-maze in mice: comparison with cognitive enhancers. Eur. Neuropsychopharmacology. 2005;15(2):230–234. DOI: 10.1016/s0924-977x(05)80455-9

13.         Ковалев Г.И., Фирстова Ю.Ю., Салимов Р.М. Влияние пирацетама и ацефена на NMDAи никотиновые рецепторы мозга мышей с различной эффективностью исследовательского поведения в крестообразном лабиринте // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т.71. – №1 – С.12–17. [Kovalev GI, Firstova YuYu, Salimov RM. Effects of piracetam and meclofenoxate on the brain NMDA and nicotinic receptors in mice with different exploratory efficacy in the cross maze test. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya. 2008;71(1):12–17. (In Russ).]. DOI: https://doi.org/10.30906/0869-2092-2008-71-1-12-17

14.         Ковалёв Г.И., Фирстова Ю.Ю., Салимов Р.М., и др. Механизмы избирательного действия Семакса при когнитивном дефиците у мышей // Психиатрия. – 2010. – Т.3. – №45. – С.23–28. [Kovalev GI, Firstova YuYu, Salimov RM, et al. Mehanizmy Mekhanizmy izbiratel'nogo dejstviya Semaksa pri kognitivnom deficite u myshej. Psihiatriya. 2010;3(45):23–28. (In Russ).]

15.         Фирстова Ю.Ю., Абаимов Д.А., Капица И.Г., и др. Влияние скополамина и ноотропного препарата фенотропила на рецепторы нейромедиаторов мозга крыс в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) // Нейрохимия. – 2011. – Т.28. – №2. – С.130–141. [Firstova YY, Abaimov DA, Kapitsa IG, et al. The effects of scopolamine and the nootropic drug phenotropil on rat brain neurotransmitter receptors during testing of the conditioned passive avoidance task. Neurochemical Journal. 2011; 5(2):115–125. (In Russ).]

16.         Seger CA. The basal ganglia in human learning. The Neuroscientist.2006;12(4):285–290. DOI: 10.1177/1073858405285632

17.         Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. Миронова А.Н. – М.: Гриф и К.; 2012. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. CHast' pervaya. Ed by Mironov A.N. Moscow: Grif I K.; 2012. (In Russ).]

18.         Miguelez C, Morera-Herreras T, Torrecilla M, et al. Interaction between the 5-HT system and the basal ganglia: functional implication and therapeutic perspective in Parkinson’s disease. Frontiers in Neural Circuits. 2014;8(21):1–9. DOI: 10.3389/fncir.2014.00021

19.         Leysen JE, Niemegeers CJ, Van Nueten JM, et al. [3H]Ketanserin (R 41 468), a selective 3H-ligand for serotonin2 receptor binding sites. Binding properties, brain distribution, and functional role. Mol. Pharmacol. 1982;21(2):301–314.

20.         Hasselbalch SG, Madsen K, Svarer C, et al. Reduced 5-HT 2A receptor binding in patients with mild cognitive impairment. Neurobiology of aging. 2008;29:1830–1838. DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2007.04.011

21.         ФирстоваЮ.Ю., ДолотовО.В., КондрахинЕ.А., идр. Влияние ноотропных препаратов на уровень BDNF в гиппокампе и коре мозга мышей с различной эффективностью исследовательского поведения // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2009. – Т.72. – №6. – С.3–6. [Firstova YuYu, Dolotov OV, Kondrakhin EA, et al. Effects of Nootropic Drugs on Hippocampal and Cortical BDNF Levels in Mice with Different Exploratory Behavior Efficacy. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya. 2009;72(6):3–6. (In Russ).]

Наши проекты

Наши партнёры