Вернуться к журналу 2018 г., №3

Изучение фармакокинетики [3H]- циклопролилглицина в крови крыс

  • 3 месяца назад
  • Журнал: 2018 г., №3
  • 307

Резюме. Изучена фармакокинетика меченого по тритию метаболита ноопепта циклопролилглицина [3Н]-ЦПГ после внутривенного болюсного введения в дозе 5,7 мкг (2 мКи). Мечение субстанции ЦПГ проводили с помощью реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена. Обнаружено, что временной характер изменений концентрации [3Н]-ЦПГ в крови крыс подчиняется двухкамерной модели. Расчёт фармакокинетических параметров показал, что α-фаза (фаза распределения) протекает очень быстро, а β-фаза элиминации [3Н]-ЦПГ достаточно продолжительна. При этом величина Т1/2α составляет 1 мин, а Т1/2β – 80 мин. Эти данные согласуются с ранее полученными результатами по фармакокинетике ЦПГ как метаболита, образующегося из лекарственного препарата ноопепт. ЦПГ существенно отличается от других дипептидных соединений по величинам фармакокинетических параметров (Т1/2e, MRT и др.), что предполагает наличие у него большей продолжительности фармакологического действия

The Study of [3H]-Cycloprolylglycine Pharmacokinetics in Rat Blood

Resume. The objective of this study is to evaluate pharmacokinetic parameters of tritium-labeled cycloprolylglycine [3H] –CPG following intravenous bolus administration of 5.7 µg (2 mCi). [3H] –CPG was prepared by solid-state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. It was found that plasma concentration-time profile of [3H] –CPG is adequately fit by a two-compartment model. The pharmacokinetic parameter estimates revealed rapid α-phase (distribution phase) (T1/2α 1 min) followed by a slower β-phase of elimination (T1/2β 80 min). These findings are consistent with previous results of pharmacokinetic study of CPG as a noopept metabolite. CPG is differ significantly from other therapeutic peptides in pharmacokinetic profile (T1/2, MRT, etc), which implies that CPG has a more prolonged duration of action.

Введение

Циклопролилглицин (ЦПГ, цикло-(Про-Гли)) был сначала описан в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова в качестве одного из основных метаболитов препарата ноопепт [1].

Впоследствии ЦПГ был обнаружен в мозге крыс с помощью ВЭЖХ и ГЖХ, а также масс-спектрометрического анализа с ионизацией электронным ударом в качестве эндогенного соединения, средняя концентрация которого составила 2,8 ± 0,3 нмоль/г сырой ткани [2]. Фармакологическое изучение позволило выявить у него антиамнестическую [3], анксиолитическую [4], антигипоксическую, нейропротекторную [5] активности, которые он проявляет в диапазоне доз от 0,05 до 1 мг/кг. Помимо этого, ЦПГ увеличивал содержание нейротрофина BDNF в культурах гиппокампальных мышиных клеток линии HT-22 и клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y как в норме, так и при моделировании повреждения с помощью глутамата и 6-гидроксидофамина [6].

Целью настоящего исследования стало изучение фармакокинетики пептида циклопролилглицин с использованием его радиоактивномеченного тритием производного [G-3Н]-ЦПГ.

Материалы и методы

Получение радиоактивномеченного тритием пептида ЦПГ. Реакцию ВТКИО с газообразным тритием проводили при температуре 170 °С в твёрдой смеси, образованной ЦПГ, нанесённым на неорганический носитель, и высокодисперсным катализатором платиновой группы. ЦПГ в количестве 1,0 мг растворяли в 1 мл воды и смешивали с 20 мг неорганического носителя. Воду удаляли при уменьшенном давлении при 20 °С. Неорганический носитель с нанесённым препаратом смешивали с 10 мг гетерогенного катализатора платиновой группы. В ампулу объёмом 10 мл помещали полученную твёрдую смесь, вакуумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 торр и проводили реакцию ВТКИО при повышенной температуре. Ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом. Пептид десорбировали 20 % водным этанолом. Для удаления лабильного трития меченый пептид ещё дважды растворяли в 20 % водном этаноле и упаривали досуха. Хроматографическую очистку проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил в градиенте метанола в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты (рис. 1). Пептид упаривали и растворяли в этаноле до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Реакцией ВТКИО с тритием были получен меченый тритием пептид [3H]-ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль в количестве 20 мКи и радиохимической чистотой более 98 %, с использованием уникальной установки по обмену водорода на тритий ОВТ-1 (Отдел химии физиологически активных веществ ИМГ РАН).

Животные и их содержание. В исследованиях использовали здоровых половозрелых крыс-самцов линии Вистар (n = 3), весом 340 ± 10 г. Содержание животных соответствовало действующим санитарным правилам по содержанию лабораторных животных. Исследование выполнялось согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [7] и Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [8]. Все процедуры в исследовании выполнялись согласно утверждённым Комиссией по гуманному обращению с животными протоколам.

Введение животным пептида ЦПГ и отбор крови. Введение пептида ЦПГ и отбор крови осуществляли через ярёмные вены. Перед введени ем пептида крыс анестезировали смесью кетамина (91 мг/кг) и ксилазина (9,1 мг/кг), после чего с вентральной стороны справа и слева препарировали две ярёмные вены и устанавливали внутривенные катетеры, слева – FlexicathG24 (Apexmed, Нидерланды), а в правую – FlexicathG22 (Apexmed, Нидерланды). В левую ярёмную вену вводили 80 мкл гепарина и затем в течение 10-15 с – раствор радиоактивно меченого пептида ЦПГ (2000 мкКи, 5,7 мг/кг) в объеме 200 мкл. По истечении определенного времени (1; 2,5; 4; 6; 10; 20; 40; 60 и 90 мин) из правой ярёмной вены отбирали примерно по 0,4 мл венозной крови, которую помещали в пластиковые пробирки и быстро замораживали в жидком азоте.

Анализ содержания пептида [3H]-ЦПГ в образцах крови. При приготовлении препаратов для ВЭЖХ анализа замороженные и взвешенные образцы крови в пластиковых пробирках подвергались лиофильной сушке в течение 2 суток. После чего, высушенные образцы прогревались для удаления пептидазной активности тканей. Для приготовления пептидного экстракта проводили последовательные экстракции органическими растворителями, упаривание под уменьшенным давлением и центрифугирование. Лиофильно высушенные образцы крови прогревали при 65 °С в течение 30 минут, после чего образцы измельчались в этих же пластиковых пробирках горизонтальными ножами, вращающимися со скоростью 5000 об./мин. Первую экстракцию этих образцов проводили 90 % водным ацетонитрилом, содержащим 1 % трифторуксусной кислоты. После центрифугирования раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции метанолом и повторному центрифугированию. Полученный при этом раствор, содержащий меченый тритием пептид и компоненты плазмы крови, подвергался сушке под уменьшенным давлением, реэкстракции 0,1 % водным раствором гептафтормасляной кислоты и последующему центрифугированию.

Радиохроматографический анализ проводили с помощью ВЭЖХ на колонке Кромасил С18,5 мкм, 150 х 4 мм в присутствии 0,1 % трифторуксусной кислоты. Выбраны условия анализа с помощью ВЭЖХ, позволяющие выделить фракцию, соответствующую ЦПГ, и отделить дипептиды PG и GР, являющиеся возможными пептидными метаболитами протеолитического гидролиза (рис. 2).

Хроматографические фракции, соответствующие пептиду ЦПГ, собирали и анализировали с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика TriCarb 2900TR (“PerkinElmer”) с эффективностью счёта 45 %. Количественные значения радиоактивномеченого ЦПГ в пробе нормировали по внутреннему стандарту.

Анализ фармакокинетических данных. Анализ фармакокинетических параметров ЦПГ проводили в рамках модельного подхода согласно Рекомендациям по проведению доклинических исследований [7]. Для расчётов параметров и построения графиков использовали программу Sigma Plot 11.0. Фармакокинетические кривые («концентрация ЦПГ-время») для расчёта фармакокинетических параметров были построены по усреднённым значениям концентраций ЦПГ в крови, полученным из данных для 3 животных.

Результаты и обсуждение

Соединения пептидной природы находят все большее применение при разработке новых лекарственных препаратов [9, 10]. Важными их преимуществами являются высокая эффективность и чрезвычайно низкая токсичность. Однако исследование их фармакокинетических свойств сопряжено с целым рядом проблем. Прежде всего это обусловлено их быстрой деградацией в тканях и образованием множества метаболитов. Уникальные возможности для получения корректных результатов при анализе фармакокинетики пептидов даёт использование равномерно меченных изотопами водорода пептидов, содержащих изотопную метку во всех аминокислотных остатках [11]. Для получения таких пептидов ранее было предложено использовать реакцию высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [12, 13]. В Отделе химии физиологически активных соединений Института молекулярной генетики РАН в течение ряда лет проводятся исследования по изучению твёрдофазных каталитических реакций с изотопами водорода, получившие признание в нашей стране и за рубежом. Важной особенностью реакции ВТКИО является то, что изотопный обмен в пептидах и белках происходит с сохранением их биологических свойств [14]. Метод позволяет получать изотопномеченные белки и пептиды, в которых атомы изотопов распределены по всей молекуле, что открывает возможность мониторинга всех фрагментов, образующихся при их протеолитическом гидролизе в тканях организма.

Эта реакция была использована при синтезе меченого по тритию дипептида ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/моль, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

На рисунке 3 приведена типичная хроматограмма, полученная в ходе анализа ЦПГ в пептидных экстрактах из образцов крови.

В результате проведённого анализа были рассчитаны значения концентрации ЦПГ в цельной венозной крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении (табл. 1).

Для расчёта фармакокинетических параметров был использован модельный подход. Минимальная ФК-модель, пригодная для описания полученных экспериментальных данных – открытая двухкамерная модель с элиминацией пептида из центральной камеры (рис. 4).

Это хорошо видно из графического представления данных (концентрация/время) в прямых и полулогарифмических координатах (рис. 5).

Убывающая моноэкспоненциальная зависимость используется для математического описания однокамерной ФК-модели, а убывающая биэкспоненциальная зависимость – для описания простейшей двухкамерной ФК-модели (рис. 1). Уравнения убывающих монои биэкспоненциальных зависимостей можно представить в виде:

Ct = A·exp(-α·t)  (1)

Ct = A·exp(-α·t) + B·exp(-β·t)        (2)

где: Ct – концентрация фармакологического вещества в крови в момент времени t; а A, B, α и β – гибридные константы (макроконстанты) интегральных уравнений (1) и (2).

В случае биэкспоненциальной зависимости (двухкамерная модель) первая экспонента (макроконстанты A и α) в основном отражает процесс распределения вещества между центральной и периферической камерами, а вторая экспонента (макроконстанты B и β) – процесс элиминации вещества из центральной камеры.

Для наилучшей подгонки значений параметров уравнений (1) и (2) (макроконстант) экспериментальным данным применяли нелинейную регрессию и метод наименьших квадратов с помощью Sigma Plot 11.0.

Корректность применения той или иной модели для описания имеющихся экспериментальных данных была оценена с помощью коэффициента детерминации (r2) и скорректированного коэффициента детерминации (adjusted r2). Значения этих и некоторых других показателей для двух рассматриваемых моделей приведены в таблице 2. Представленные результаты указывают на то, что экспериментальные данные хорошо описываются биэкспоненциальной зависимостью (уравнение (2)). Следовательно, полученные экспериментальные данные (табл. 2) корректно анализировать в рамках двухкамерной ФК-модели.

С использованием нелинейной регрессии определены значения макроконстант в уравнении (2) (табл. 3).

Исходя из значений макроконстант были рассчитаны значения микроконстант k10, k12 и k21 (см. схему на рис. 1), периодов полуэлиминации фазы распределения (T1/2α) и фазы элиминации (T1/2β) и ряд системных ФК-параметров (табл. 4).

Усреднённая концентрационная кривая [3H]ЦПГ и рассчитанные из неё фармакокинетические параметры исследуемого соединения в крови животных после однократного внутривенного введения (в/в) представлены на рис. 5 и в табл. 4. [3H]ЦПГ определялся в крови на протяжении 90 минут. Кажущаяся начальная концентрация (С0) ЦПГ в плазме крови крыс составила 25,01 нг/мл. Его период полуэлиминации (T1/2β) составил 79,7 минут.

Ранее на крысах была изучена фармакокинетика соединения дипептидной структуры – ноопепта, обладающего ноотропной активностью. В результате исследования биотрансформации ноопепта были установлены химические структуры его метаболитов. Среди основных продуктов биотрансформации был обнаружен циклопролилглицин [1].

Величина периода полуэлиминации (T1/2el) ЦПГ после в/в способа введения ноопепта крысам в дозе 5 мг/кг составила 2,65 ч (159 мин) и MRT – 2,52 ч (151,2 мин) [15]. Следовательно, T 1/2el ЦПГ после в/в введения ноопепта значительно больше аналогичного параметра незамещенных дии трипептидов.

Например, период полуэлиминации пептидного соединения – анксиолитика ГБ-115 у крыс после его перорального введения в дозе 100 мг/кг составил 0,24 ч (14,4 мин) и MRT – 0,28 ч (16,8 мин) [16].

Величина T1/2el другого пептидного вещества – нейролептика дилепта у крыс после его перорального введения в дозе 200 мг/кг составила 0,55 ч (33,0 мин) и MRT – 0,85 ч (51,0 мин) [17].

Учитывая, что период полуэлиминации ЦПГ после его в/в введения составил около 80,0 минут, ЦПГ можно отнести к группе «долгоживущих» лекарственных веществ пептидной природы. Такие ФК-параметры, как T1/2elи среднее время удерживания вещества в организме (MRT – 111,2 мин) указывают на относительно долгое нахождение исследуемого вещества в системном кровотоке животных.

Таким образом, ЦПГ в сравнении с другими пептидными соединениями более длительно выводится из организма крыс как в качестве метаболита, образующегося после введения ноопепта, так и при непосредственном его введении как лекарственного вещества.

Выводы

1.           Реакцией ВТКИО с тритием получен меченый тритием пептид ЦПГ с молярной радиоактивностью 54 Ки/ммоль и радиохимической чистотой более 98 %, что позволило использовать его для проведения фармакокинетических исследований на экспериментальных животных.

2.           C использованием радиоактивномеченного тритием производного проведено исследование фармакокинетики [3Н]-ЦПГ в крови крысы при однократном внутривенном болюсном введении пептида. Показано, что изменение   концентрации [3Н]-ЦПГ в крови (во времени) соответствует двухкамерной ФК-модели, описываемой двухэкс поненциальным уравнением. Это может быть обусловлено наличием достаточно ёмкого депо ЦПГ, характеризующегося относительно медленным накоплением и высвобождением пептида.

3.           На основе модельного подхода рассчитаны значения модель-зависимых параметров (микроконстанты k10, k12 и k21) и системных фармакокинетических параметров (AUC, MRT, kel, ClT, Vd). Они свидетельствуют об относительно низкой скорости элиминации (kel) и о продолжительном времени удерживания [3Н]-ЦПГ в организме – 0,03 мин-1 и 111 мин соответственно.

4.           После однократного внутривенного болюсного введения в дозе 5,7 мг/кг ЦПГ в организме крыс определяется на протяжении 90 минут. Величина периода полувыведения ЦПГ из крови составила 80 минут и среднего времени удерживания вещества в организме – 111 минут.

5.           Большой период полувыведения [3Н]-ЦПГ в β-фазе позволяет отнести его к относительно долгоживущим соединениям с пептидной структурой.

Литература / References

1.           Бойко С.С., Жердев В.П., Гудашева Т.А., и др. Фармакокинетика нового потенциального дипептидного ноотропного препарата ГВС-111 и его метаболитов в мозге крыс // Химико-фармацевтический журнал. – 2001. – № 9. – С.11–13. [Boiko SS, Zherdev VP, Gudasheva TA, et al. Pharmacokinetics of the new potential dipeptide nootrope gvs-111 and related metabolites in rat brain. Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal. 2001;35(9):11–13. (In Russ).] DOI: 10.1023/A:1014082406443

2.           Gudasheva TA, Boyko SS, Ostrovskaya RU, et al. Identification of a novel endogenous memory facilitating cyclic dipeptide cyclo-prolylglycine in rat brain. FEBS Letters. 1996; 391:149–152. DOI: 10.1016/00145793(96)00722-3

3.           Гудашева Т.А., Островская Р.У., Трофимов С.С., и др. Новый эндогенный дипептид циклопролилглицин подобен пирацетаму по селективности мнемотропного эффекта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1999. – Т. 128. – № 10 – С.411–413. [Gudasheva TA, Ostrovskaya RU, Trofimov SS, et al. New endogenous dipeptide cycloprolyl-glycine is similar to piracetam by its mnemotropic selectivity. Bulletin of experimental biology and medicine. 1999;128(4):411– 413. (In Russ).]

4.           ГудашеваТ.А., КонстантинопольскийМ.А., ОстровскаяР.У., идр. Анксиолитическая активность эндогенного ноотропного пептида циклопролилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2001. –Т.131. – № 5 – С.464–466. [Gudasheva TA, Konstantinopol'skii MA, Ostrovskaya RU, et al. Anxiolytic activity of endogenous nootropic dipeptide cycloprolylglycine in elevated plus-maze test. Bulletin of experimental biology and medicine. 2001;131(5): 464–466. (In Russ).]

5.           КолясниковаК.Н., ГудашеваТ.А., НазароваГ.А., идр. Сходство цикло-пролилглицина с пирацетамом по антигипоксическому и нейропротекторному эффектам // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. – Т. 75. – № 9 – С.3–6. [Kolyasnikova KN, Gudasheva TA, Nazarova GA, et al. Similarity of cycloprolylglycine to piracetam in antihypoxic and neuroprotective effects. Russian Journal of Experimental and Clinical Pharmacology. 2012;75(9):3–6. (In Russ).]

6.           ГудашеваТ.А., КолясниковаК.Н., АнтиповаТ.А., идр. Нейропептид циклопролилглицин увеличивает содержание мозгового нейротрофического фактора в нейрональных клетках // Доклады академии наук. – 2016. – Т. 469. – №4 – С.492–495. [Gudasheva TA, Kolyasnikova KN, Antipova TA, et al. Neuropeptide cycloprolylglycine increases the levels of brain-derived neurotrophic factor in neuronal cells. Doklady Akademii nauk. 2016;469(4):492–495. (In Russ).] DOI: 10.7868/S0869565216220254

7.           Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. – М.: Гриф и К.; 2012. с. 944. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstvennykh sredstv. Ed by Mironov AN. Moscow: Grif i K.; 2012. (In Russ).]

8.           Национальный стандарт Российской федерации, ГОСТ Р 53434 – (2009). [Natsional'nyi standart Rossiiskoi federatsii, GOST R 53434 – (2009). (In Russ).]

9.           Malavolta L, Cabra FR. Peptides: Important tools for the treatment of central nervous system disorders. Neuropeptides. 2011;45(5):309–316. DOI: 10.1016/j.npep.2011.03.001

10.         Diao L, Meibohm B. Pharmacokinetics and pharmacokineticpharmacodynamic correlations of therapeutic peptides. Clinical Pharmacokinetics. 2013;52(10):855–868. DOI: 10.1007/s40262-013-0079-0

11.         Zolotarev YuA, Dadayan AK, Bocharov EV, et al. New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids. 2003; 24(3): 325–333. DOI: 10.1007/s00726-002-0404-7

12.         ЗолотаревЮ.А., ДадаянА.К., ДолотовО.В., идр. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их биодеградации in vivo и in vitro // Биоорганическая химия. – 2006. – Т. 32. – №2 – С.183– 191.         [Zolotarev YuA, Dadayan AK, Dolotov OV, et al. Evenly tritium-labeled peptides in study of peptide in vivo and in vitro biodegradation. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2006;32(2):183–191. (In Russ).]

13.         Zolotarev YuA, Dadayan AK, Kozik VS, et al. Solid-state isotope exchange with spillover hydrogen in organic compounds. Chem. Rev. 2010;110(9):5425–5446. DOI: 10.1021/cr100053w

14.         Zolotarev YuA, Dadayan AK, Borisov YuA, et al. New development in the solid-state isotope exchange with spillover hydrogen in organic compounds. J. Phys. Chem. C. 2013; 117(33):16878–16884. DOI: 10.1021/jp4015299

15.         Коротков С.А. Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта. Дис. … канд. биол. наук. – М.; 2003. [Korotkov SA. Eksperimental'noe izuchenie farmakokinetiki i biotransformatsii novogo dipeptidnogo nootropa noopepta. [dissertation] Moscow; 2003. (In Russ).] Доступнопо: http:// medical-diss.com/medicina/eksperimentalnoe-izuchenie-farmakokinetikii-biotransformatsii-novogo-dipeptidnogo-nootropa-noopepta

16.         Раскин С.Ю., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., и др. Фармакокинетика дипептидного анксиолитика ГБ-115 после перорального введения у различных видов животных и человека // Фармакокинетика и фармакодинамика. – 2017. – №3. – С.20–25. [Raskin SYu, Kolyvanov GB, Litvin AA, et al. Pharmacokinetics of dipeptide anxiolytic GB-115 after oral administration in different animals species and humans. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2017;(3):20–25. (In Russ).]

17.         ШевченкоР.В., ЛитвинА.А., КолывановГ.Б., идр. Особенности фармакокинетики оригинального нейролептика дилепта у животных и человека // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2014. – Т.77. – №7. – С.23–26. [Shevchenko RV, Litvin AA, Kolyvanov GB, et al. Specific features in pharmacokinetics of the original neuroleptic dilept in animals and humans. Russian Journal of Experimental and Clinical Pharmacology. 2014; 77(7): 23–26. (In Russ).]. DOI: https:// doi.org/10.30906/0869-2092-2014-77-7-23-26

Наши проекты

Наши партнёры